在顯微鏡中，一個重要的持續(xù)目標是希望更清楚地看到較小的東西。由于光的衍射極限，傳統(tǒng)的光學顯微鏡面臨大約200-250納米的分辨率極限。為了觀察樣品的較小特征，科學家們可以應用超分辨率顯微鏡，它可以顯示尺寸僅為幾十微米的細節(jié)。這些用于成像樣品的新技術提供的分辨率曾經看起來太好了，不能真正打破看似牢不可破的障礙。科學家必須考慮這些方法的優(yōu)缺點，然后找到**適合特定研究目標的方法。

通常，超分辨率顯微鏡包括一些不同類型的技術，例如受激發(fā)射耗盡顯微鏡（STED）。另一種超分辨率方法是單分子定位顯微鏡，包括光活化定位顯微鏡（PALM）和隨機光學重建顯微鏡（STORM）。一些科學家還將結構化照明顯微鏡（SIM）添加到超分辨率方法列表中，但其他人會說這種技術無法比共聚焦顯微鏡更好地成像。

本文將簡要介紹這些技術的工作原理。在STED顯微鏡中，激光在非常有限的區(qū)域或焦點上打開和關閉熒光標記。然后，這些激光掃描樣品以產生圖像。在某些情況下，STED可以與活細胞成像相結合。對于PALM和STORM，熒光團也不會同時被激活。以這種方式，熒光標記以可用于構建極高分辨率圖像的序列打開。然而，PALM和STORM都不是活細胞成像的理想選擇，但這些方法可以相對容易地轉變?yōu)槠脚_。SIM技術創(chuàng)建了在圖像上移動的網格狀光圖案，然后傅立葉變換用于生成圖像。

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鑒于這項技術被稱為超級分辨率，它有多好？簡短的回答是：比普通光學顯微鏡更好。因此，這意味著超分辨率顯微鏡必須提供可以分辨小于200納米的細節(jié)的圖像。但是，有些方法比其他方法更好。SIM的分辨率約為100納米，約為普通光學顯微鏡的兩倍。對于STED，一些平臺提供30納米分辨率的活細胞，15個細胞固定。通過PALM或STORM，科學家們可以看到僅約15納米的細節(jié)。

更好的成像不僅僅是更好的分辨率。

正如已經指出的那樣，更好的成像不僅僅是關于更好的分辨率。目標是看到更小的東西，并能夠描述和解釋它們是什么。因此，超分辨率顯微鏡的信噪比也很重要。更高的信噪比可以創(chuàng)建更清晰的圖像，而這可能是**重要的。具體的比較取決于所使用的特定平臺，樣品和成像條件，但差異可能很大。例如，牛津大學**成像部門經理Ian DObbie及其同事表示，  SIM在一次比較中產生的信噪比是STED的900多倍。對于科學家來說，知道什么是signal-t0-noISE是可能的，有時只需要比較幾種或更多種方法。

時間考慮因素也起作用。如果科學家需要了解某些東西是如何移動的，那么**好的選擇就是它取決于它。如果事情很重要，SIM可以非常快速地跟蹤運動，但它不能提供足夠的分辨率來對分子進行分析。STED可用于跟蹤，速度取決于圖像的大小，因為STED掃描它。PALM和STED也可以跟蹤動態(tài)事件，但不是很快，因為這些方法將數千個圖像合并為一個。

除了基本技術，科學家們不斷擴展超分辨率顯微鏡的功能，這里有幾個**近的例子。

修改方法

要真正了解生物系統(tǒng)如何工作，必須在上下文中查看組件，這可能需要三維（3D）成像。一些技術以高分辨率提供3D成像，但對樣本不是很深。因此，LaboratoirepHotoniqueNumériqueetNanosciences的研究員Pierre Bon和他的同事開發(fā)了一種名為SELFI的方法，他們將其描述為“多細胞標本和組織中3D單分子定位的框架。”使用這種技術，科學家們成像肌動蛋白絲在樣品表面下方低**50微米。在這項工作中，科學家們使用了球體 - 細胞的3D培養(yǎng)物 - 這些材料甚**不需要在這些深度進行成像清除。

如上所述，在某些應用中可能需要在空間和時間上進行成像。這可以通過各種方式完成，并且新方法不斷涌現。**近，洛桑聯邦理工學院生物醫(yī)學光學實驗室負責人Theo Lasser建立了一個結合3D超分辨率顯微鏡和3D相位成像的平臺，可用于繪制細胞甚**細胞器，科學家稱之為一臺4D顯微鏡。

科學家可以購買一個，而不是建立超分辨率系統(tǒng)。例如，尼康生產的N-SIM超分辨率顯微鏡可用于活細胞成像，每秒可拍攝15幀。來自奧林巴斯的科學家們可以購買IXplore SpinSR10超分辨率成像系統(tǒng)，該系統(tǒng)專為活細胞成像而設計，可提供120納米的分辨率。尼康和奧林巴斯系統(tǒng)都可以在不同形式的成像之間切換。例如，奧林巴斯文獻指出IXplore SpinSR10可以“在超分辨率，共焦和寬場成像之間切換。”為了探索多個細節(jié)，科學家們可以從徠卡顯微系統(tǒng)中選擇HyVolution 2，它可以提供140納米的分辨率并成像多個熒光團。超分辨率系統(tǒng)甚**不需要占用大量實驗室空間。例如，GE Healthcare將其DeltaVision OMX SR描述為“專門為結構化照明顯微鏡（SIM）超分辨率技術提供穩(wěn)定平臺的緊湊型成像系統(tǒng)”，并且可用于多種模式進行活細胞成像，包括動態(tài)圖像捕獲。 這只是一小部分可用選項。

在進入超分辨率顯微鏡之前，要做出的各種決策和需要考慮的技術需要科學家進行一些研究，但對研究的影響可以使時間得到很好的投入。科學家在樣本中可以辨別的細節(jié)越多，我們就能越了解周圍的世界。