眼見為實，對于許多生物學家來說，他們想要看到的是通過顯微鏡觀察熒光標簽。熒光顯微鏡使得在細胞和亞細胞水平上可視化熒光蛋白或染料成為可能，已成為現(xiàn)代生物學的主力。

1852年，英國科學家喬治&midDOt;斯托克斯爵士**描述了熒光的概念，其中一個分子吸收一個波長的光，然后發(fā)出更長波長的光。但這種技術是以高分辨率設想這一過程并使用它的技術。自20世紀10年代德國物理學家設計早期熒光顯微鏡以來，為了照亮細胞過程已經走過了漫長的道路?？茖W家們在20世紀30年代開始使用熒光染料對組織進行染色，并于1942年開始使用熒光標記的抗體。1961年發(fā)現(xiàn)的水母綠色熒光蛋白有助于推動該領域的發(fā)展，因為它使科學家能夠標記各種有熒光的蛋白質。 

在過去的幾十年中，科學家已經開發(fā)了許多基于熒光顯微鏡的方法，不僅可以對分子的位置進行成像，還可以對它們如何移動和相互作 

購買熒光顯微鏡時，科學家有很多選擇可供選擇，在決定之前需要考慮很多因素。本買方指南討論了儀器如何工作，它們可以用于什么以及在為您的研究需求選擇系統(tǒng)時應該考慮什么。 

基礎

降低到**基本的水平，熒光顯微鏡檢查涉及照射具有某些波長的光譜的樣品，然后檢測發(fā)射的熒光團。所以這一切都始于光源。訣竅是平衡入射或激發(fā)光的強度。

它越強，從樣品中獲得的熒光就越多，或者發(fā)出的熒光就越多。但強烈的激發(fā)光也會損壞樣品 - 甚**殺死活細胞或組織 - 或導致其中的熒光團“漂白”并隨著時間變得變暗。

落射熒光顯微鏡

顯微鏡學家有三個主要選擇：白色燈，LED或激光。弧光燈和LED照亮了所謂的落射熒光顯微鏡中的整個樣品。燈是**常見的光源，含有汽化汞和放電白光等氣體。然后，顯微鏡必須包括一個或多個濾光片，將光譜縮小到所需的波長 - 光譜的藍綠色部分，例如，激發(fā)樣品中的綠色熒光蛋白。這些顯微鏡一次將整個樣品浸泡在光線下，因此可以將它們光漂白。在使用顯微鏡之前，燈泡需要一些時間進行預熱，它們通?？梢猿掷m(xù)使用幾百小時才會褪色并燒壞。當它們褪色時，它們提供不同的強度，使得難以精確地比較甚**幾周之間進行的實驗。

LED是另一種更新的選擇，越來越受歡迎。在這種情況下，每個LED在光譜的有限部分產生光，因此與使用白光時相比，需要的濾波更少。與弧光燈相比，LED需要更少的功率，持續(xù)數千小時而不會褪色，并且不需要時間來預熱或冷卻。他們還立刻將整個樣品洗凈; 然而，它們通常不像燈泡那么強烈，因此導致光漂白的可能性較小。它們比燈便宜，價格在幾美元左右。

來自光源的激發(fā)光從二向色鏡反射，以將其引向樣品。在那里它激發(fā)熒光團，然后發(fā)射出自己的更長波長。然后通過物鏡收集該光，這放大了圖像并且對于確定分辨率和圖像質量是**關重要的。給定的物鏡不僅具有給定的放大率（10倍，100倍等），而且還具有數值孔徑的數量。數值孔徑越高，所得圖像的分辨率和亮度越高。一些物鏡具有額外的透鏡以**小化圖像中的像差。

影響圖像的另一個因素是光線在通往該物鏡的途中經過的介質。 

如果光首先穿過空氣，然后撞擊物鏡的玻璃，一些光將在該邊界處散射，因為空氣和玻璃具有不同的折射率。浸入介質（例如油）具有折射率以匹配物鏡并使光散射**小化。

樣品熒光團發(fā)出的光比激發(fā)光暗得多，激發(fā)光也被樣品反射。這就是為什么將激發(fā)光反射到樣品上的二向色鏡是重要的。它允許發(fā)射光的波長在進入顯微鏡的過程中通過，但阻擋強激發(fā)波長。發(fā)射的光還通過發(fā)射濾光器，其僅選擇所研究的熒光團的輸出波長。這些激發(fā)和發(fā)射濾光片必須與您希望使用的任何熒光團相匹配。

然后信號可以傳遞到目鏡，因此您可以查看樣品。但當然，大多數科學家都希望記錄他們所看到的內容。主要的相機選項是電子倍增電荷耦合器件（EMCCD）或互補金屬氧化物半導體（CMOS）。兩者都是敏感的數碼相機，可將入射光轉換為電信號。EMCCD長期以來一直是標準，并且被認為更敏感，特別是在低光條件下，但CMOS相機正在改進。它們可以提供更快的圖像采集，更大的視野和更好的分辨率。

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共聚焦顯微鏡

如落射熒光顯微鏡那樣，用入射光擊中整個樣品意味著在所需視平面上方和下方的熒光團發(fā)光，限制分辨率。為了消除這一挑戰(zhàn)，共聚焦顯微鏡  使用激光。使用鏡子，他們可以將光線聚焦在一個點上，因此樣品中其他地方的熒光團不會被激發(fā)。在發(fā)射端，還有一個帶針孔的屏幕，用于將光從樣品限制到所需的焦點。

在激光掃描共聚焦顯微鏡中，機器掃描平面上的激發(fā)光點，并提供比落射熒光通常提供的更清晰的圖像。改變平面的水平導致在不同深度處的圖像的“堆疊”，從而給出了樣本的三維布置的概念。

激光掃描共聚焦顯微鏡只是共聚焦顯微鏡的一個版本。相比之下，旋轉磁盤和可編程陣列顯微鏡可以激發(fā)來自激光或落射熒光源的激發(fā)光 - 通過多個針孔掃描圖像。優(yōu)點是這些系統(tǒng)可以更快地獲得圖像，這對于活細胞中的成像活動可能是**關重要的。然而，激光掃描共聚焦顯微鏡通常提供**高分辨率。

查找，比較和評論
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像燈一樣，激光在成像前需要一些預熱時間，并且它們的強度**終會消失。但就像LED一樣，激光持續(xù)很長時間，也許是幾千小時。激光是**昂貴的光源，運行數千美元。

為了檢測和放大弱發(fā)射光，共聚焦顯微鏡使用光電倍增管。入射光子首先擊中光敏光電陰極，它吸收光子并發(fā)射電子。然后該電子與一系列電極相互作用，每個電極發(fā)射的電子多于它吸收的電子。結果是信號的放大。

表：熒光顯微鏡

應用

“現(xiàn)在幾乎每個人都在使用熒光，” 伊利諾伊大學厄巴納 - 香檳分校BECkman**科學與技術研究所的顯微鏡套件經理斯科特羅賓遜說  。“你想做的事情真的很廣泛。”

“**重要的是蛋白質定位，” 威斯康星大學麥迪遜分校Newcomb成像中心的植物學家兼主任Sarah Swanson說  。“你可以將你的GFP附加到你**喜歡的感興趣的蛋白質上，看看它在活細胞中的位置。”或者，通過將GFP連接到感興趣的啟動子，可以觀察到表達水平如何隨時間變化。

與熒光團連接的抗體也可以點亮感興趣的蛋白質。同樣，熒光標簽可以幫助科學家看到細胞和細胞器等結構的形狀。

雖然人們可以隨時固定組織并觀察它們，但活細胞成像也變得非常流行。研究人員可以隨著時間的推移跟蹤感興趣的蛋白質或結構，使他們能夠觀察到穩(wěn)態(tài)活動，或者看看當他們用藥物或其他影響因素擾亂系統(tǒng)時會發(fā)生什么。

對于長期的實時成像，在溫度控制和適當水平的氧氣和二氧化碳的情況下，保持細胞在顯微鏡臺上舒適的腔室是**關重要的。

顯微鏡也已進入高通量篩選應用領域，使用自動顯微鏡可以在科學家參與其他地方的過程中觀察多個細胞。這使研究人員能夠檢查藥物庫或各種治療是否會影響蛋白質的位置或活性并量化其結果。對于這些類型的實驗，挑戰(zhàn)變成處理和分析所有圖像。

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共定位

因為光有這么多顏色，科學家可以看到同一樣品中的多種蛋白質或染料，只要它們的激發(fā)和發(fā)射波長不同。這使得可以確定感興趣的蛋白質或膜是否共同定位 - 表明它們居住在相同的空間中并且可以相互作用或不相互作用。

另一種觀察樣品中兩種標記分子之間相互作用的方法是Förster共振能量轉移（FRET）。當兩個熒光團彼此在納米范圍內時，一個熒光團的發(fā)射可以激發(fā)另一個熒光團的熒光。“供體”熒光團的發(fā)射波長必須與“受體??”的激發(fā)光譜重疊。因此，通過用顯微鏡光激發(fā)供體，人們應該能夠觀察受體的發(fā)射。通過這種方式，科學家們可以確定兩個分子，甚**是同一蛋白質的兩個部分，彼此靠近。

研究離子

蒙特利爾麥吉爾大學的寄生蟲學家Petra Rohrbach表示，她的激光掃描共聚焦顯微鏡幾乎是她所有實驗的組成部分。她對瘧疾寄生蟲如何處理藥物，將它們泵入寄生蟲的酸性消化液泡以及使用活細胞成像來觀察處理感興趣。例如，她添加了熒光染料，寄生蟲就像是一種有毒藥物一樣處理，她可以在顯微鏡下觀察處理過程。

她還使用染料來指示鈣的濃度，膜上的電位或pH值。例如，通過用熒光染料加載寄生蟲，熒光染料隨pH變化而變色，她可以監(jiān)測消化液泡的酸度。如果其pH值向中性蔓延，則消化酶將無法發(fā)揮作用。羅爾巴赫說，殺死這種寄生蟲可能部分是因為它無法消化其食物。

Swanson也在研究植物如何對壓力源做出反應時使用離子敏感染料。例如，當植物彎曲并且機械應力時，鈣水平會飆升。使用能夠改變熒光，向下或不同顏色的染料 - 當被鈣結合時，她可以觀察活植物組織中發(fā)生的情況。遺傳編碼的離子指示器可以執(zhí)行相同的功能。

激光技巧

某些共焦顯微鏡中的激光不僅僅是成像。研究人員還利用它們來評估他們所看到的分子是如何移動的。隨著光漂白后的熒光恢復（FRAP），科學家們利用了太強的光可以破壞熒光團這一事實。他們在視野的一部分消滅熒光團，然后觀察熒光何時返回。該區(qū)域的原始熒光團消失了，因此返回的熒光必須與從其他地方遷移的新熒光團有關。這使研究人員能夠觀察擴散或主動販運的動態(tài)。

其變體是FLIP，其代表光漂白中的熒光損失。FLIP幫助科學家確定樣品的哪些區(qū)域相互連接，并允許材料在它們之間擴散。研究人員反復光漂白一個斑點，一旦它們進入就會摧毀任何熒光團。在與該斑點相互連接的地方，整體熒光逐漸減弱。通過這種方式，生物學家可以確定區(qū)域的邊界。

對于許多實驗室來說，熒光成像是他們研究的生命線。“這是我們所做的一切，實際上，”  北卡羅來納大學教堂山分校的Amy Gladfelter說  。她研究細胞質和質膜是如何組織的，并使用活細胞成像，F(xiàn)RAP和其他技術來了解蛋白質和細胞器如何排列和移動。她還使用先進的技術，專注于蛋白質在整個細胞中以及在細胞或體外的單個分子中移動的速度。

購物點

在試用潛在購買時需要檢查很多東西。一個問題是易用性。顯微鏡可以并且確實帶有許多鈴聲和口哨聲，但當然這些功能僅在您需要它們的功能時才有用。那些有相當基本需求的人可能更喜歡細胞成像系統(tǒng)。這些簡化的顯微鏡比傳統(tǒng)的全功能顯微鏡小，易于使用，具有觸摸屏界面。有些包括遮光罩，因此您無需在暗室中對細胞進行成像。這些對于與學生一起工作特別有利，他們不會被設備嚇倒，并且可以專注于圖像。

顯微鏡簡單或花哨，科學家應該考慮他們需要什么樣的成像模式。

除了多種顏色的熒光之外，研究人員通常希望通過相位對比成像來觀察具有透射白光的細胞。羅爾巴赫說，確切地知道細胞的邊界在哪里，這總是有用的。您可以使用的顏色數量 - 例如，顯微鏡可以與之連接的激光線數量 - 對于那些使用許多不同熒光團的人來說也是一個重要因素。

分辨率是一個需要考慮的關鍵特性，因為它決定了您能夠區(qū)分哪些類型的特征。由顯微鏡和使用中的物鏡決定的視場也很重要。例如，觀察神經元的科學家可能需要足夠大的視野來觀察所有樹突和軸突到達的位置，但研究細菌的研究人員可能會對較小的視野感到滿意。Robinson補充道，另一種可能性是，某些顯微鏡軟件可以自動將多個圖像拼接在一起，從而創(chuàng)建來自幾個小視野的大視圖。

買家需要做的另一個選擇是使用直立顯微鏡 - 其中物鏡朝下放置在舞臺上的樣品 - 或倒置顯微鏡，其中物鏡朝上。倒置系統(tǒng)通常用于研究培養(yǎng)細胞，因為細胞**寬的部分是接觸培養(yǎng)皿表面。羅賓遜說，當然，如果樣本很大 - 例如用于活體顯微鏡檢查的動物 - 只有直立的樣本。

您還需要決定是否要讓目鏡透過，或者只是想要樣品的數字圖像。Rohrbach指出，有些顯微鏡缺少目鏡。

如果您無法立即負擔所需的所有功能，請尋找可在實驗室中更新的顯微鏡 - 例如，通過添加用于活細胞成像的培養(yǎng)箱--Robinson建議。同時，尋找在您所在地區(qū)擁有技術支持的公司，以便您在需要時快速獲得幫助。

概要

雖然光學顯微鏡的基礎 - 光子進入樣品并在光學引導下返回 - 已有數百年歷史，但熒光顯微鏡仍在不斷發(fā)展。科學家和工程師正在開發(fā)更加靈活的方法來改進靈敏度和分辨率等功能。例如，超分辨率技術的出現(xiàn)意味著科學家們現(xiàn)在可以在不到200納米的范圍內區(qū)分細胞特征。

即使制造商使用**新的花哨更新他們的產品，他們也正在創(chuàng)建簡化，價格合理的產品，幫助實驗室訪問熒光顯微鏡。那些只想觀察一兩種蛋白質的人可能能夠使用方便的細胞成像系統(tǒng)。對于那些考慮更**應用的人 - 例如活細胞成像，F(xiàn)RAP或FRET顯微鏡（如共聚焦系統(tǒng)）提供了更多選擇。

科學家在購買顯微鏡時有很多選擇。問自己的關鍵問題是：“我將使用它來做什么？”這應該讓您清楚地了解所需的功能。

編者注：我們要感謝并感謝Bio-Rad實驗室全球產品經理VeronIKA Kortisova-Descamps女士對本文的深刻討論和貢獻。